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山茱萸多糖的提取及含量测定

目的从山茱萸中提取多糖,并建立山茱萸多糖含量的测定方法。方法采用均匀设计优化山茱萸多糖的提取条件,用热水浸提、乙醇沉淀、DE-52柱层析的方法提取纯化山茱萸多糖,用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。结果山茱萸中多糖的含量为16.04%,平均回收率为99.01%,RSD=1.13%(n=3)。结论首次运用均匀设计优化山茱萸多糖的提取条件,提取得率高,苯酚-硫酸比色法测定山茱萸多糖含量稳定性、回收率较好。
xtraction and Determination of the Content of Polysaccharide from Fructus Corni
Abstract:ObjectiveTo extract polysaccharide and establish the method for determination of the content of polysaccharides from Fructus Corni. MethodsUniform design test was used to extract polysaccharides from Fructus Corni. Polysaccharide was purified by water extraction ,ethanol sedimentation, DE-52 chromatography. The content of polysaccharide was determined by phenol-vitriolic colorimetry. ResultsThe content of polysaccharide in the Fructus Corni was 16.04%,the average recovery was 99.01%,and RSD was 1.13%(n=3).ConclusionIt is the first time that uniform design is used to optimize extraction conditions of polysaccharide. The extraction rate of polysaccharide is high. Phenol-vitriolic colorimetry was a stable and reproduciable method to determine content of polysaccharide in Fructus Corni.
Key words:Fructus Corni;   Polysaccharide;  Uniform design;  Extraction 
山茱萸[1](Fructus Corni)为山茱萸科植物山茱萸Cornus Officinalis Sieb.et Zucc.的干燥果肉,又名山萸肉、药枣、肉枣等,临床上以除去种子的成熟果实入药,其味酸、涩、微温,归肝肾经,有补益肝肾、涩精固脱的功效,是我国传统的中药材。中医药临床研究证明[2,3],山茱萸是治疗糖尿病、冠心病和高血压病的主要药材。果肉中主要成分有糖类、有机酸类及其酯类、鞣质类等。多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质,具有多种生物活性而成为当今生物医药研究和开发的一大热点。本文以山茱萸为材料,采用均匀设计实验[4]优化山茱萸多糖提取条件,并通过乙醇沉淀,DE-52柱层析进一步纯化,用苯酚-硫酸比色法测定山茱萸多糖的含量。
1  器材
1.1  材料山茱萸干燥果实(产地:河南西峡县,购自药店)。
1.2  试剂D(+)-葡萄糖(Fluka进口分装,上海华硕精细化学品有限公司);重蒸苯酚(北京市双翔达生化试剂);DE-52(进口分装,whatman产品,国药集团化学试剂有限公司);其他试剂均为国产分析纯。
1.3  仪器TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);台式离心机(太仓市医疗器械厂);数显恒温水浴锅HH-6(国华电器有限公司);中兴高速万能粉碎机(中兴伟业有限公司);旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);层析装置(上海沪西分析仪器厂)。
2  方法与结果
2.1  山茱萸多糖的提取与纯化
2.1.1  山茱萸多糖的提取纯化工艺流程干燥的山茱萸果实粉碎→100目筛筛分→山茱萸粉末→八倍体积95%乙醇回流8 h脱脂→冷却抽滤→滤渣晾干→预处理的山茱萸粉末→水浸提→离心→上清液→合并上清液→浓缩→乙醇沉淀→干燥得粗多糖。粗多糖溶于水→透析→DE-52柱层析纯化→收集部分多糖洗脱液浓缩→乙醇沉淀→冷冻干燥→白色山茱萸多糖。
2.1.2  均匀设计实验优化山茱萸多糖的提取条件选择提取温度、提取时间和料液比3个因素,以山茱萸多糖的提取得率为考察指标进行三因素八水平的均匀设计实验如表1。称取一定量的预处理的山茱萸粉末,以不同的料液比、提取温度、提取时间在恒温水浴中保温浸提,4 000 r/min离心15 min,合并上清液,加入3倍体积95%的乙醇,4℃放置24 h离心得粗多糖,热水溶解,定容,苯酚-硫酸法[5]测定多糖的含量,计算多糖得率。结果见表1。
多糖得率(mg/g)=(C×D×V×f)/W,式中:C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(mg/ml)。D为多糖溶液的稀释倍数,V多糖溶液的体积(ml),f为山茱萸多糖的换算因素,W为预处理的山茱萸粉末质量(g)对实验结果利用王玉方的均匀设计软件2.10,采用后退法(显著性水平α=0.05)进行回归分析,拟建立回归方程:y = b(0) + b(1)*X(1) + b(2)*X(2) + b(3)*X(3),分析结果如下:回归系数 b(i):b(0)=-98.7;b(1)= 33.01e-2;b(2)= 1.37;b(3)= 2.86;即回归方程为y=-98.7+ 33.01e-2*X(1) +1.37*X(2) + 2.86*X(3)利用网格尝试法对实验条件进行优化,得出实验的优化条件如下:最佳提取温度为100℃,提取时间为180 min,料液比1∶36,预期指标最大值为(199.97±14.28)mg/g。
2.1.3  验证实验为了验证优化结果的可靠性,我们选择了X1=100℃,X2=180 min,X3=1:36进行验证实验,平行操作3份,平均得率是 199.36 mg/g,与预测值相近,此均匀设计有意义。
2.1.4  山茱萸多糖的纯化取少量粗多糖溶于蒸馏水,离心,上清液用DE-52柱层析纯化,用梯度浓度为0~1 mol/L NaCl溶液各250 ml进行梯度洗脱,流速2 ml/min,分部收集洗脱液,每管收集10 ml,苯酚-硫酸法跟踪检测,绘制洗脱曲线。结果见图1。合并单一主峰部分(12~25号管),透析,浓缩,用乙醇沉淀,冷冻干燥,即得白色山茱萸多糖。
2.2  山茱萸多糖含量的测定
2.2.1  最大吸收波长的选择配制不同浓度的葡萄糖标准溶液和山茱萸多糖溶液,用苯酚-硫酸法显色,在波长400~600 nm范围内扫描,得吸收光谱相似,都在489 nm处有最大光吸收,因此测定波长选择489 nm。
2.2.2  标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg置100 ml容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1 mg/ml的葡萄糖溶液,稀释为0.10 mg/ml的葡萄糖标准溶液。分别精确吸取葡萄糖标准液(浓度:0.10 mg/ml)0.0,0.1,0. 2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 ml于试管中,加蒸馏水补至1 ml,加入5%苯酚(冰箱中避光保存)1 ml,混匀,迅速加入5 ml浓硫酸,混匀,室温静置30 min。在489 nm处测其吸光值。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。结果见图2。在10~70 μg/ml浓度范围内呈线性关系。回归方程C=0.000 54 A+0.093 28  相关系数r=0.999 84。
2.2.3  转换系数的测定精确称取山茱萸多糖35 mg置于100 ml容量瓶中,热水溶解定容,精密吸取0.1 ml按苯酚-硫酸法测定其吸光值,由回归方程计算多糖中葡萄糖的浓度。按下式计算转换系数:f=W/CD,式中:W为山茱萸多糖的质量(mg),C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(mg/ml),D为多糖溶液的稀释因素,测得f=4.2。
2.2.4  稳定性实验精密吸取样品溶液适量,按“2.2.2”的方法测定吸光值,每隔30 min测定1次,连续测定3 h,结果吸光值的RSD为1.46%,说明苯酚硫酸显色后,样品在3 h内基本上稳定。
2.2.5  样品测定分别精确称取粉碎的山茱萸粉末2.00,2.02,2.07,2.06 g,用八倍体积的95%乙醇回流8 h,离心去除上清液。沉淀中加入一定体积的蒸馏水,100 ℃反复回流提取,提取液定容在250 ml容量瓶中,摇匀成为样品液。测定时,精确吸取适量样品液,按测定标准曲线同样的方法测其吸光值,以葡萄糖作标准品,根据回归方程计算待测样品中葡萄糖的浓度,按下式计算样品中多糖的含量:多糖含量(%)=(C×D×V×f/W)×100式中:C为样品溶液的葡萄糖的浓度(mg/ml)。D为样品溶液的稀释倍数,f为换算因素,V多糖的体积(ml),W为样品的质量(mg),测得平均结果为16.04%,RSD=1.03%(n=4)。
2.2.6   回收率实验精密称取山茱萸粉末1.0 g,共5份,分别精密加入适量的山茱萸多糖,按“2.2.5”进行分析,测得平均回收率为99.01%,RSD为1.5%。
3  结论
在多糖提取过程中,利用单糖、多糖在95%乙醇中溶解性的差异,对原材料预处理时采用乙醇回流可以有效地去除单糖,多糖提取液采用乙醇沉淀可以有效地分离浓缩多糖。采用均匀设计试验对山茱萸中多糖的提取条件进行优化。最佳提取条件:料液比为1∶36,提取温度为100℃,提取时间180 min,山茱萸多糖的得率可达199.36 mg/g(相对于预处理的山茱萸粉末)。用苯酚-硫酸法测定山茱萸多糖的含量为16.04%,山茱萸多糖转换系数为4.2。建立山茱萸多糖的提取和含量测定方法,为下一步对山茱萸多糖的大规模提取和生物活性研究分析奠定了基础。
参考文献:
[1]  方家选,杨志欣,梁新武 .南阳中草药名典[M].南阳:三秦出版社,2004:454.
[2]  周京华,李春生,李电东.山茱萸有效化学成分的研究进展[J].中国新药杂志,2001,10(11):808.
[3]  杨  云,刘建鑫,刘翠平,等.山茱萸多糖的化学研究[J].中国中药杂志,1999,24(10):614.
[4]  方开泰.均匀设计与均匀设计表[M].北京:科学出版社,1994.
[5]  张惟杰.糖复合物生化研究技术,第2版[M].杭州:浙江大学出版社,1999:11.
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