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纤维素酶用于山茱萸提取的初步研究

目的对酶法提取山茱萸总皂苷的酶解条件进行了初步研究,考察了酶解时间、酶用量、酶解温度和酶解初始pH值对总皂苷产量的影响。方法采用紫外可见分光光度法测定总皂苷含量,检测波长为554 nm。结果确定了酶解的最优条件为:酶解时间为150 min,酶量为5 U/g,酶解温度为45℃,酶解初始pH=5.4。结论酶法能显著提高山茱萸总皂苷的提取率。

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc的干燥成熟果肉,具有补益肝肾、涩精固脱的功能。化学成分分析表明,山茱萸果实中含有大量维生素、各种氨基酸、环烯醚萜苷类、皂苷、熊果酸、齐墩果酸等药用及营养保健成分。近年研究发现山茱萸总皂苷具有较强的免疫抑制作用,是山茱萸作为免疫抑制的主要有效成分。为了提高山茱萸总皂苷的利用率,充分发挥其功效,人们研究了许多山茱萸总皂苷的提取方法。这些传统方法在一定的程度上提取了总皂苷,但效果不尽理想。目前,酶法已广泛应用于植物有效成分的提取中,并已显示出其优越性。本文把纤维素酶用于山茱萸提取的研究,现报道如下。

1、材料与仪器
纤维素酶,购于北京双旋微生物培养基制品厂;人参皂苷Re购于中国药品生物制品检定所;冰醋酸,莱阳市双双化工有限公司,高氯酸,天津市东方化工厂,香草醛、甲醇,天津市富宇精细化工公司,试剂均为分析纯;山茱萸药材,产地河南洛阳地区,经鉴定均来源于山茱萸科植物的成熟果实;上海精密仪器厂722型分光光度计。

2、方法
2.1  山茱萸中总皂苷提取工艺称取山茱萸原料5.000 g,置于100   ml圆底烧瓶中,酶解,反应一定时间后取出趁热过滤,收集滤夜,浓缩蒸干后,用甲醇溶解定容10 ml容量瓶中,作为储备液,备用。

2.2  含量测定吸取“2.1”项下的储备液10μl于具塞试管中,70℃水浴蒸干,精密加入0.2 ml 50 g·L-1香草醛冰醋酸溶液和0.8 ml高氯酸,振摇混匀后于65℃水浴加热20 min,冰水冷却5 min,加冰醋酸5 ml摇匀,以相同试剂为空白对照,在波长554 nm处测定吸光度,以标准曲线法计算总皂苷含量。

3、结果与讨论
3.1  标准曲线的绘制及线形范围精密称取人参皂苷Re对照品5.000 mg,以甲醇溶解并定容于5 ml容量瓶中,配制成1 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取该溶液50,70,100,150,170,200,250 μl,置10 ml具塞试管中,按“2.2”项下操作。以吸光度对浓度进行回归,方程为A=16.084C-0.013,相关系数r=0.999 8。表明总皂苷在0.008 3~0.041 7 mg/ml的浓度呈良好的线性关系。

3.2  酶法回流提取与直接回流提取的比较称取5 g山茱萸粉末两份,加十倍量的95%乙醇,一份加1 g 左右的纤维素酶,调pH值5.0左右,在温度50℃回流2 h,蒸干溶剂,按照“2.2”项下测定其A值,并计算结果,见图1。

从图1可以看出在纤维素酶的作用下,提高了总皂苷的含量和产率,这是因为纤维素酶可以破坏植物的细胞壁而使有效成分提取率提高,使药材得到充分利用,纤维素酶应用于中药有效成分的提取越来越显示出其有效性。

3.3  酶解时间的影响在酶解初始pH、酶量和酶解温度一定的条件下,考察不同酶解时间对山茱萸总皂苷提取含量的影响,结果见图2。

从图2可以看出,在酶解初始pH值、酶解温度和酶量一定的条件下,总皂苷产量先随酶解时间的增加而增加,150 min时达到最大值。这是因为随着时间的延长,酶活力得到充分的利用,酶解反应进行得较完全,随着酶解时间的增加总皂苷产量几乎不变。因此150 min为最佳酶解时间。

3.4  酶量的影响在酶解初始pH、酶解时间和酶解温度一定的条件下,考察酶量对山茱萸总皂苷提取含量的影响,结果见图3。

从图3可以看出,在酶解液初始pH值、酶解时间和酶解温度一定的条件下,总皂苷产量先随酶量的增加而增大,在酶量为5 U/g时,总皂苷产量达最大值,此后急剧下降而趋于平衡。这是因为在一定实验条件下,酶量低于最佳值时,酶解未进行完全,底物过量,致使总皂苷产量不高,达到最佳值时,酶解进行得较彻底,此时如果继续增加酶量,酶解进行程度不会增加反而下降,具体原因有待进一步研究。因此,综合各方面因素,确定在实验条件下酶解提取辣椒素的酶量最佳值为5 U/g。

3.5  酶解温度的影响在酶解初始pH、酶量和酶解时间一定的条件下,考察酶解温度对山茱萸总皂苷提取含量的影响,结果见图4。

从图4可以看出,在其它条件固定的情况下,总皂苷产量先随酶解温度升高而增加,在40℃时为最大值,40℃后温度再升高,总皂苷含量减小。这是因为温度影响酶活性具有双重效应,温度升高时反应速度也加快,同时也加速酶变性失活。最适温度以下时前者占优势,最适温度以上时后者起主导作用,因此,酶解温度高于最适温度40℃,酶活性迅速丧失,总皂苷产量减少。

3.6  pH值变化的影响在酶量1、酶解温度和酶解时间一定的条件下,考察pH值对山茱萸总皂苷提取含量的影响,结果见图5。

从图5可以看出,在其它条件一定的情况下,总皂苷产量先随酶解初始pH 值的增大而增大,在pH=4.5时达到最大值,当pH值达到4.5后再增加酶解初始pH值,总皂苷产量反而随pH值的增大而减小。这是因为pH值会影响底物分子的解离状态,也会影响酶分子的解离状态,最适pH与酶活力中心结合底物的基团及参与催化的基团的pK值有关,往往只有一种解离状态最有利于与底物结合,在此pH下酶活力最高。在本实验中,pH值为4.5时该纤维素酶酶活最高,总皂苷产量最高。

4、结论
利用酶法提取山茱萸总皂苷,能显著提高提取率;纤维素酶可以用于山茱萸总皂苷提取,方法简单方便,适于工业化生产。

酶法提取山茱萸总皂苷的最佳酶解条件是:酶解时间150 min,酶量5 U/g,酶解温度40°,酶解pH=4.5。

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