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不同浓度山茱萸多糖对HDF细胞衰老的影响

【摘要】  
目的 
研究不同浓度山茱萸多糖对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)的影响,探讨制备含山茱萸多糖家兔血清的最佳采血时间。方法 选择家兔为对象,制备含山茱萸多糖血清,DMEM培养基培养复制性衰老HDF细胞;采用苯酚硫酸法测定多糖含量,MTT法检测细胞活力。将HDF细胞分为4组,观察不同浓度含山茱萸多糖家兔血清培养基对衰老HDF细胞细胞活力的影响。结果 血清中山茱萸多糖浓度在给药1.5,2,4 h明显高于给药0.5、11 h(P<0.001),给药2,2.5,3,3.5,4 h高于0.5、11 h(P<0.01),而在给药48,72 h则明显降低(P<0.01)。培养基中加入含山茱萸多糖兔血清(SCP)0.5%、1%和1.5%均能提高衰老HDF细胞活力(P<0.01),细胞衰老表型不明显,其中1%SCP组效果好于0.5%,1.5%组。而2%SCP组和 3%SCP组表现明显的细胞生长抑制。结论 制备含山茱萸多糖家兔血清最佳取血时间是在给药后1.5~2 h或4 h,山茱萸多糖抗HDF细胞衰老作用效果最好的是1%含山茱萸多糖兔血清组。

山茱萸具有补肝肾、益精气、降血糖、抗菌、利尿、降压和免疫功能〔1〕。现代药理学研究表明山茱萸具有抗氧化、抗实验性肝损害、促进免疫反应、抗类风湿关节炎、抗炎、降血糖、抗休克、强心、抗艾滋病、治疗不育症、抗癌和降血脂等作用。
〔2〕,有良好的应用前景。但是不同浓度含山茱萸多糖血清的制备过程中家兔血液的最佳采样时间、对HDF细胞衰老作用及理想用药剂量的研究目前未见报道。本研究为进一步开拓山茱萸多糖的临床应用,探讨其药理作用及机制奠定实验基础。

1 材料与方法
1.1 材料 HDF细胞系(南京凯基生物公司),小牛血清、胰蛋白酶、MTT 粉、DMSO(北京华美公司),DMEM(Invitrogen 公司)。家兔25只,由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 山茱萸多糖(FCP)含药血清的制备及测定
1.2.1 含药血清的制备 家兔按每公斤体重78 mg生药提取的多糖给药,连续给药7 d。给药前心脏取血1 ml作为空白对照,在给药后0.5,1,1.5,2.0,2.5,3,3.5,4,5,6,7,9,11,24,48 h分别心脏取血1 ml,静置析出血清后,4℃ 12 000 r/min离心20 min,56℃灭活30 min,0.22 μm滤膜过滤。细胞培养用含药血清的制备:连续灌胃5 d,最后一次灌胃1.5 h同法制备含药血清,采用同种灭活法制备正常兔血清(SB),分别混合SCP和SB,-20℃保存。

1.2.2 血清中含药浓度测定 采用苯酚硫酸法〔3〕。①标准曲线绘制:以葡萄糖作对照,以质量浓度C对625 nm吸光度A进行线性回归,A=0.007 98+4.317C,r=0.997 2;②含药血清FCP的测定:取100 μl供试样品加乙醇250 μl,漩涡混合1 min,静置10 min,12 000 r/min,离心15 min,沉淀加蒸馏水1 ml混匀后12 000 r/min,离心5 min,上清液冻干,加重蒸水溶解定容至1 ml,采用马振宇等方法〔4〕处理血清,苯酚硫酸法测定血清中多糖的含量,每份样品重复测定5次。以时间为横坐标,血清中多糖浓度为纵坐标,做浓度时间曲线。

1.3 FCP血清药理作用的研究 20代HDF细胞作为青年对照组,用含10%小牛血清的DMEM 培养液培养至45代,分为对照组和山茱萸多糖血清(SCP)实验组,SFCP实验组又分为0.5%SCP组(0.5% SCP +9.5%SB)、1% SCP组(1% SCP +9%SB)、1.5% SFCP组(1.5% SCP +8.5%SB)、2%SCP组(2% SCP +8%SB)和3% SFCP组(3%SCP +7%SB),并以SB作对照(衰老组)。小于35代为年轻细胞,大于55代为衰老细胞。采用MTT法检测细胞活力,常规显微镜下观察细胞形态学变化。

1.4 统计学处理 数据以x±s表示,组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 给药不同时间家兔血清多糖含量的变化 对10只家兔给药不同时间多糖浓度测定的结果,见图1。在给药后1.5 h和4 h出现2个最高浓度时间的变化,在两个高峰之间维持平均浓度在15.467 μg/ml的较高浓度状态,在给药6h后开始出现下降。而培养用药物血清多糖浓度为22.86 μg/ml。

2.2 不同浓度SCP对HDF细胞形态学变化的影响 青年组细胞生长状态良好,细胞排列整齐,呈长梭形或不规则形,无角质形成,细胞混染生长。衰老对照组细胞排列不规则,体积较大,形态扁平,胞浆区域增大,细胞质/细胞核的比例增加,胞浆中可见较多颗粒或空泡,年轻细胞仅偶见。不同SCP作用后,与正常衰老组对照细胞比较在形态上有明显的差别,衰老表型不十分一致。0.5%SCP、1%SCP和1.5%SCP组细胞生长比较好,排列较衰老对照组整齐,细胞体积明显变小,胞浆偶见空泡和颗粒;2%SCP和3%SCP组细胞数量较少,胞浆偶见空泡或颗粒。
2.3 不同浓度SCP对HDF细胞对数生长期(d)和细胞活力的影响 见表1、图2、图3。衰老对照组细胞活力明显低于青年对照组,0.5%至1.5%的SCP可以明显提高衰老HDF细胞活力(P<0.01),但未达到青年对照组水平,而2%和3%的SCP表现不同程度的抑制HDF细胞生长的作用,细胞活力无明显变化。青年组细胞最大增殖数约为47.3×105,衰老细胞最大增殖数各为8.5×104,SCP组细胞最大增殖数依次为10.6×104,11.5×104,10.7×104,6.5×104和3.5×103。青年对照组细胞对数生长期在2~4 d之间,细胞群体倍增时间为2.18 d;衰老对照组细胞对数生长期在4~7.5 d,细胞群体倍增时间为3.86 d。SCP组细胞对数生长期分别在3.5~7 d,细胞群体倍增时间依SCP浓度依次为3.34,3.05,3.91,7.12 d,3%SCP表现为细胞生长的明显抑制。表1 不同浓度SCP对HDF细胞对数生长期(d)和细胞活力的影响

3 讨 论
为合理解释中药作用,采用给动物灌服中药一定时间后,取动物的血清进行实验,可深入揭示药物的作用机制,同时又能防止中药粗制剂本身理化性质对实验的干扰〔5〕。刘成海等〔6〕研究表明体外培养实验中宜采用同一血清,既为细胞培养提供营养、又为药物提供载体,还避免了由血清引起的多种干扰作用,一般首选家兔和大鼠。本实验结果表明,在给药后1~2 h家兔血清山茱萸多糖的浓度达到第一个峰值,故在给药后1~2 h采集动物血清可获得较高浓度的含药血清。血药浓度与药物作用的强度成正比,血药浓度系指药物吸收后在血浆内的总浓度,包括与血浆蛋白结合的或在血浆游离的药物,药物在体内的浓度随着时间而变化。故确定给药后合适的采集血样时间直接影响血药浓度,并对实验产生直接影响。本研究中选择给药后2 h采血制备药物血清,测定结果也说明在给药后2 h血清药物多糖含量处于理想水平。自Harrison首创组织培养法以来,体外细胞培养很快用于衰老的研究。

体外细胞的衰老与体内组织的衰老有相关性〔7〕。HDF在体外传代约50代之后,细胞逐渐丧失分裂能力,细胞内颗粒增多,体积变大,成为衰老的HDF。本研究表明采用SCP培养衰老HDF细胞,在SCP较低浓度时具有改善衰老HDF生长状态的作用,而在较高浓度时则抑制细胞的生长。0.5%SCP,1%SCP和1.5%SCP均表现不同程度地提高细胞活力,衰老表型不明显。其机制可能通过调节HDF细胞cyclinD1、CDK4和p16的表达,发挥对细胞周期的调控作用〔7~9〕。

细胞的衰老表型至少包括三个因素:生长停止、形态上体积的增大及基因表达的改变。而生长停止本身,例如细胞的无血清培养,并不会引起衰老表型的出现。而实验结果表明2%SCP和3%SCP培养结果并不是出现了衰老的改变,而属于生长停止。故在较低浓度时山茱萸多糖药理血清表现出较好的抗HDF细胞衰老作用,其理想的含山茱萸多糖血清添加浓度在0.5%~1%。但关于高浓度SCP抑制HDF细胞生长的机制尚有待于进一步的研究。

【参考文献】
1 刘德军,路 涛.山茱萸〔M〕.北京:中国中医药出版社,2001:l12,3551.
2 戴建子,张志豪,唐 蕾,等.山茱萸化学成分及药理作用研究进展〔J〕.中国药业,2006;15(2):745.
3 杨勇杰,姜瑞芝,陈英红,等.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究〔J〕.中成药,2005;27(6):7068.
4 马振宇,吕志华,王远红,等.HPLC 法测定兔血清中海洋硫酸多糖聚甘古酯的浓度〔J〕.中国海洋大学学报,2006;5(36):7882.
5 孙 蓉,刘国卿.中药血清药理学在神经药理学研究中的应用和规范化〔J〕.中药药理与临床,2005;21(2):645.
6 刘海成,刘 成,刘 平,等.抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨〔J〕.中药实验方剂学杂志,1998;4(2):169.
7 欧 芹,王雅丽,魏晓东,等.山茱萸多糖对HDF细胞β半乳糖苷酶及p16表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(4):3257.
8 蔡 霞,张 鹏,唐胜建,等.正常人成纤维细胞老化过程中β半乳糖苷酶的变化〔J〕.解剖科学进展,2004;10(1):911.
9 王雅丽,欧 芹,魏晓东,等.山茱萸多糖对衰老HDF细胞cyclinD1、CDK4表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2008;28(8):73941.
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